2.結(jié)果與分析

2.1 pH對(duì)PPP-NP粒徑和Zeta-電位的影響

蛋白質(zhì)熱聚集顆粒的形成是蛋白質(zhì)分子之間的靜電和疏水相互作用的一種競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液中的親水基團(tuán)能夠提供足夠的排斥力時(shí)，蛋白質(zhì)的聚集就會(huì)停止。相反，當(dāng)疏水基團(tuán)的作用很強(qiáng)時(shí)，會(huì)給蛋白質(zhì)的聚集帶來動(dòng)力。粒徑和多分散性系數(shù)（Polydispersity index，PDI）測(cè)量通常用于表征溶液中的聚合物聚集情況；Zeta-電位用于表征溶液的電負(fù)性，分析溶液中分子間的靜電相互作用。研究表明，蛋白質(zhì)分子之間的作用力不僅與它們自身的特性有關(guān)，而且還取決于外部的加工環(huán)境條件。

圖1A測(cè)定了不同pH對(duì)PPP-NP粒徑的影響。

如圖1A所示，PPP-NP的粒徑在45~120 nm之間，在pH6.5時(shí)，PPP溶液的粒徑在110 nm左右，且擁有最低的PDI（0.19），表明PPP在pH6.5下形成的PPP-NP是分布最均一的。由圖1B可知，PPP-NP電位的絕對(duì)值隨著pH的增加而增大，大豆蛋白熱聚集體也有相同的趨勢(shì)。在pH4.0時(shí)，Zeta-電位值為正，主要是由于此時(shí)pH<5.5（PPP的等電點(diǎn)（Isoelectric point，pI）為5.5），溶液帶正電荷；當(dāng)pH≥6.5時(shí)，Zeta-電位的絕對(duì)值隨pH增大的原因是此時(shí)溶液距離pI越來越遠(yuǎn)，攜帶更多的負(fù)電荷。綜上所述，在pH6.5下PPP-NP粒徑最大，為110 nm。且PDI值最低，說明在此pH下，PPP-NP的粒徑分布集中，分散性好。

2.2 PPP-NP的表面形貌

用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡研究的PPP-NP的形態(tài)如圖2所示。根據(jù)粒徑結(jié)果，可得出pH6.5下PPP-NP的PDI值低，粒徑分布集中，因此以pH6.5制備的PPP-NP為代表。由圖2A所示，此條件下PPP-NP尺寸均勻。在圖2B放大5萬倍下更為清晰地觀察到這一現(xiàn)象。顆粒尺寸大小和分布情況符合圖2A的結(jié)果。這些PPP-NP以適當(dāng)?shù)某叽缰圃煲苑€(wěn)定Pickering乳液。

由圖2A可知PPP-NP的粒徑大小在45~120 nm之間，較小的顆粒具有較快的吸附動(dòng)力學(xué)，它們可以更快更準(zhǔn)確地吸附在水包油界面上，從而使界面得到更大程度的填充，從而形成更穩(wěn)定的Pickering乳液。均一的粒徑分布和低PDI值是穩(wěn)定Pickering乳液的關(guān)鍵。在pH6.5下制備的PPP-NP不僅粒徑分布均勻一致，并且兼具吸附動(dòng)力學(xué)優(yōu)勢(shì)，因此具有更高的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 pH對(duì)PPP-NP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

使用遠(yuǎn)紫外圓二色光譜測(cè)量pH對(duì)PPP-NP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。圖3為圓二色光譜圖，表1為二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量分析。由表1可知，PPP含有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲四種二級(jí)結(jié)構(gòu)組分：α-螺旋和β-折疊代表蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)；β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲則代表蛋白質(zhì)的無序結(jié)構(gòu)。與未經(jīng)任何處理的對(duì)照（control group，con）相比，在調(diào)節(jié)pH后經(jīng)過加熱的樣品，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量顯著減少約19.2%~34.5%，β-折疊含量顯著增加6.9%~47.2%，無規(guī)卷曲含量降低8.7%~20.2%。α-螺旋減少的原因是由于熱處理會(huì)導(dǎo)致α-螺旋中的氫鍵損傷，而氫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力。

β-折疊含量增加是由于熱處理能打開蛋白結(jié)構(gòu)，暴露疏水性基團(tuán)，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)間的相互作用，進(jìn)而通過分子間β-折疊形成蛋白聚集體。與中性和堿性條件相比，酸性（pH4.0）條件下的α-螺旋含量較低，這可能是由于α-螺旋主要是由氫鍵穩(wěn)定的，而PPP的pI約5.5，此時(shí)蛋白是帶負(fù)電荷，酸性環(huán)境可能會(huì)增加由于電荷中和而增加蛋白質(zhì)之間的靜電作用力，從而影響氫鍵的穩(wěn)定性。靜電作用力和氫鍵的變化會(huì)導(dǎo)致酸性條件下α-螺旋的損失。研究表明，其他來源的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化也有相似的規(guī)律，例如，Wu等將蕓豆蛋白進(jìn)行低pH熱處理，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變形和重組，從而使β-折疊含量增加。在pH6.5~8.0范圍內(nèi)，α-螺旋和β-折疊含量變化不顯著，說明在此范圍內(nèi)的pH的變化不足以引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。并且，在此范圍內(nèi)，pH6.5下PPP-NP的β-折疊含量相對(duì)最高。已經(jīng)有相關(guān)研究表明，β-折疊含量的增加可能會(huì)提高顆粒的界面吸附能力。因此，pH6.5下PPP-NP具有較強(qiáng)的降低界面張力能力，這與后面的界面吸附特性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互論證。

2.4 pH對(duì)PPP-NP界面吸附特性的影響

由于從乳液界面去除吸附顆粒需要巨大的解吸能量，因此顆粒的界面吸附被認(rèn)為是一個(gè)不可逆的過程。PPP-NP在油-水界面的吸附可能包括至少兩個(gè)階段：第一階段PPP-NP接近乳液界面并滲透到油-水界面，第二階段顆粒附著在界面，導(dǎo)致粘彈性界面膜的形成。由于乳化劑的界面特性是評(píng)估其穩(wěn)定乳液能力的關(guān)鍵因素，因此測(cè)定了不同pH條件下PPP-NP的界面張力的變化。

如圖4所示，所有樣品在前200 s內(nèi)界面張力值急劇下降，這是由于PPP-NP開始附著在油水界面上。界面張力的快速下降是PPP-NP具有有效乳化劑的一個(gè)基本特征。隨后，界面張力值下降速度減慢直至達(dá)到平衡，這是由于顆粒在油水界面的堆積和結(jié)構(gòu)重排，接近平衡狀態(tài)意味著顆粒即將終止分子構(gòu)象的重排。在所有pH條件下，界面張力值均隨著時(shí)間的推移而降低，表明PPP可以在各種pH條件下在油水界面處吸附。界面張力的降低會(huì)降低吉布斯表面自由能，從而提高界面層的穩(wěn)定性。與con相比，所有樣品的最終平衡值均小于con，這可能是由于con未經(jīng)加熱處理，而實(shí)驗(yàn)組在熱處理過程中球狀蛋白質(zhì)的展開（以及疏水部分的暴露）的結(jié)果，說明PPP-NP的乳化性優(yōu)于PPP。有些蛋白加熱聚集后降低界面張力的能力增加，因此穩(wěn)定油水界面能力增強(qiáng)，乳化性和乳化穩(wěn)定性改善。