晶體-細胞相互作用的蛋白質組學：腎結石研究的模型

腎結石/尿石癥（即腎結石?。┤匀皇且粋€全球公共衛生問題，發病率/患病率不斷上升。腎結石最常見的化學成分是草酸鈣，它通過結晶、晶體生長、晶體聚集、晶體細胞粘附和通過腎間質中的細胞外基質侵入來引發結石形成。在這些過程中，晶體-細胞相互作用（定義為“細胞通過粘附在細胞表面或內化到細胞中的晶體的任何方式的影響而改變細胞的現象，伴隨著晶體的變化，例如，細胞誘導的生長，粘合能力，降解等”）對于晶體在腎臟中的保留非常重要。在過去的12年中，蛋白質組學已廣泛應用于腎結石研究，旨在更好地了解腎結石形成的致病機制。本文概述了該領域的當前知識，并總結了從所有將蛋白質組學應用于晶體-細胞相互作用研究的研究中獲得的數據，這些研究隨后導致了功能研究，以解決表達蛋白質組學數據在腎結石疾病發病機制中的顯著影響或功能作用。

1.引言

腎結石病仍然是一種常見的人類疾病，在全球發達國家和發展中國家都可以找到[1，2，3]。腎結石主要由含鈣晶體組成，特別是草酸鈣（CaOx）一水合物（COM）和二水合鈣（COD）[1，2，3]。腎結石形成的機制過程相當復雜，涉及結晶、晶體生長、晶體聚集、晶體細胞粘附以及通過腎間質中的細胞外基質（ECM）侵入晶體[4，5，6]。結晶既可以在腎小管內（管內模型）內發生，也可以發生在腎間質（蘭德爾斑塊模型）[4，5，6]。晶體形成后，單個晶體通過晶體生長或聚集機制成為較大的顆粒[7，8]。此外，晶體-細胞粘附導致晶體潴留到腎小管或間質內[9，10]。粘附的晶體可以內化到腎小管細胞中進行降解，反之亦然，通過炎癥級聯反應進一步增強結石形成過程[11，12]。最后，在腎間質中形成的內化晶體可以使用纖溶酶-纖溶酶原途徑[13]通過ECM侵入或遷移到其他部位，隨后引發組織炎癥和侵蝕[14，15]。

有趣的是，晶體保留和結石形成的關鍵過程之一是晶體-細胞粘附步驟，需要“晶體-細胞相互作用”，這可以在這里定義為細胞被粘附在細胞表面或內化到細胞中的晶體的任何影響而改變的現象，伴隨著晶體的變化，例如，細胞誘導的生長、粘合能力、降解等。使用術語“相互作用”是通過晶體和細胞之間的“相互作用”來邏輯的。很明顯，晶體可以引起細胞中的許多變化，從輕度到重度細胞毒性[14，15，16]。另一方面，細胞的組成，特別是在頂端表面和內吞囊泡中，會影響晶體的生長，粘合能力和降解[17，18]。這種相互作用可以增強腎內晶體的保留和晶體進入腎小管細胞的內吞作用。此外，晶體-細胞相互作用也可導致腎小管細胞損傷和炎癥級聯反應，從而進一步增強結石形成過程[14，15，16]。

在蛋白質組學時代，蛋白質組學已被廣泛應用于各種腎臟疾病[19，20，21]。在過去的12年中，蛋白質組學已廣泛應用于腎結石疾?。ㄓ绕涫荂OM和COD類型）的研究，旨在更好地了解腎結石形成的致病機制[22，23]。本文總結了所有將蛋白質組學應用于晶體-細胞相互作用研究的研究，這些研究隨后導致了功能研究，以解決表達蛋白質組學數據在腎結石疾病發病機制中的顯著影響或功能作用。請注意，這些研究應用蛋白質組學從結石形成者中鑒定尿液或腎結石基質中的蛋白質，而沒有任何證據表明“晶體-細胞相互作用”（見上面的定義），被排除在本評價之外（因為其中許多蛋白質只是與尿液中的結石調節劑混合，或者只是在結石腫大期間通過停滯卡在結石基質內，而在結石發病機制中沒有任何作用）。腎結石研究中與CaOx晶體-細胞相互作用的蛋白質組學相關的所有相關研究總結在表1并討論如下。

表1與CaOx晶體-細胞相互作用的蛋白質組學相關的所有相關研究摘要。

年作者/參考文獻晶體-細胞相互作用的條件蛋白質組學技術/功能檢測主要發現不同劑量和類型的CaOx晶體對腎小管細胞細胞蛋白質組的影響2008塞曼戈恩等[24]細胞：MDCK細胞（全細胞）

晶體：100μg/mL COM

培養：48小時2-DE，西普羅紅寶石染色，Q-TOF質譜和質譜/質譜11種上調和5種下調蛋白質，在轉錄/翻譯，信號轉導，細胞代謝和生長，核和細胞結構，運輸，應激反應和生物合成中發揮作用。2008通布克德五世等[25]]細胞：MDCK細胞（全細胞）

晶體：1000μg/mL COM孵育：48小時2-DE，西普羅紅寶石染色，Q-TOF質譜和質譜/質譜鑒定出25種上調和23種下調蛋白質。當伴侶被上調時，參與蛋白質合成，細胞周期調節，細胞結構和細胞信號傳導的其他蛋白質被下調。2008塞曼戈恩T等[26]細胞：MDCK細胞（全細胞）

晶體：100μg/mL COD

孵育：48小時2-DE，西普羅紅寶石染色，Q-TOF質譜和質譜/質譜5種上調和5種下調蛋白質，控制細胞代謝，結構，完整性，信號轉導和應激反應。2010陳S等[27]]細胞：HK-2細胞（全細胞）

晶體：200μg/mL COM

培養：12小時2-DE銀二胺染色，LC-靜電放電微粒/微粒9種上調和3種下調蛋白質，在能量產生，細胞增殖，細胞凋亡，應激反應，鈣平衡和蛋白質合成中起作用。2011蔣宗華等[28]細胞：MDCK細胞（全細胞）

晶體：100μg/mL COD

孵育：48小時2-DE、Pro-Q祖母綠糖蛋白染色、西普羅紅寶石總蛋白染色、Q-TOF質譜和質譜/質譜在16種顯著改變的糖蛋白中，3個蛋白酶體亞基的糖型上調，而肌動蛋白相關蛋白3（ARP3）的糖型下調。2012柴亞里特S等[29]細胞：MDCK細胞（純化的線粒體）

晶體：100微克/毫升COM

孵育：48小時2-DE，深紫色染色，Q-TOF質譜和質譜/質譜，氧合分印跡測定12種上調和3種下調線粒體蛋白，調節細胞結構，新陳代謝和能量產生。COM晶體還誘導線粒體功能障礙和氧化修飾蛋白在細胞中的積累。2017維奈法特A等[30]細胞：MDCK細胞（全細胞）

晶體：100/1000μg/mL COD/COM

培養：48小時蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析，熒光素-熒光素酶ATP測定，氧化印跡測定，泛素化蛋白質的測量，細胞死亡測定和晶體-細胞粘附測定與低劑量相比，高劑量的這些晶體引起細胞蛋白質組更明顯的變化，并且COM比COD更有效地誘導細胞蛋白質組的改變。用高劑量處理的細胞具有更高水平的細胞內ATP，氧化修飾蛋白和細胞死亡，但泛素化蛋白水平較低。COM也誘發比COD更嚴重的細胞毒性。用抗氧化劑EGCG對細胞進行預處理可以降低晶體誘導的氧化修飾蛋白的積累和細胞的晶體結合能力。2018皮拉彭P等[31]]細胞：MDCK細胞（全細胞）

晶體：1000μg/mL COM孵育：48小時蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析、增殖測定、傷口愈合測定、氧化印跡測定、熒光素-熒光素酶ATP測定和經上皮耐藥性（TER）測量用1000μg/mL COM晶體處理的細胞毒性細胞在細胞增殖，傷口愈合能力，TER以及緊密連接蛋白zonula閉塞-1（ZO-1）和信號蛋白RhoA的水平方面存在降低。相反，細胞內ATP和氧化修飾蛋白的水平升高。腎小管細胞頂端表面COM晶體受體的蛋白質組鑒定2011方恩根等[32]細胞：MDCK細胞（純化的頂端膜）

晶體：COM

孵育：過夜甲基纖維素/質譜、Q-TOF質譜和質譜/質譜、晶體細胞粘附測定、抗體中和測定共鑒定出96個潛在的COM晶體受體。膜聯蛋白II作為COM晶體受體的作用通過使用特異性抗體的中和測定得到證實。2012舒替蓬坦酸S等[33]]細胞：MDCK細胞（全細胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

孵育：30分鐘，72小時2-DE、西普魯比紅寶石染色、Q-TOF質譜和質譜分析、晶體-細胞粘附測定、鈣誘導測定、抗體中和測定膜聯蛋白A1作為COM晶體受體。2013坎拉亞R等[34]]細胞：MDCK細胞（全細胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

培養：30分鐘，72小時2-DE、西普羅紅寶石染色、Q-TOF質譜和質譜/質譜、晶體細胞粘附測定、草酸鹽誘導試驗、抗體中和測定A-烯醇化酶作為COM晶體受體。2016皮拉彭P等[35]]細胞：MDCK細胞（全細胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

孵育：30分鐘晶體-細胞粘附測定、鈣誘導測定膜聯蛋白A1作為COM晶體受體。2016方恩根等[36]細胞：MDCK細胞（整個細胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

孵育：1小時晶體細胞粘附測定、抗體中和測定A-烯醇化酶作為COM晶體受體。2016方恩根等[37]細胞：MDCK細胞（全細胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

培養：1小時，48小時晶體-細胞粘附測定、晶體內化測定、抗體中和測定、小干擾RNA（siRNA）敲低蛋白質HSP90用作COM晶體受體。2016馬尼索恩J等[38]]細胞：MDCK細胞（全細胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

孵育：30分鐘晶體-細胞粘附測定、蛋白質過表達、草酸鹽誘導測定A-微管蛋白過表達導致三種COM晶體受體的下調，包括α烯醇化酶，HSP70和HSP90，并降低了細胞的晶體結合能力。2016彭薩庫爾N等[39]]細胞：MDCK細胞（全細胞）

晶體：100μg/mL COM

孵育：30分鐘晶體-細胞粘附測定、siRNA蛋白質敲低、草酸鹽誘導測定層粘連蛋白A/C敲低導致四種COM晶體受體的水平降低，包括維生素A，α烯醇化酶，S100和膜聯蛋白A2，并且細胞的晶體結合能力下降。2018馬尼索恩J等[40]]細胞：HEK293T細胞（全細胞）

晶體：100μg/mL COM

培養：1小時晶體-細胞粘附測定，通過siRNA敲低蛋白質HSP90用作COM晶體受體。2018維奈法特A等[41]細胞：MDCK細胞（整個細胞和純化的頂膜）

晶體：100μg/mL COM

孵育：1小時晶體-細胞粘附測定、晶體內化測定、抗體中和測定PMCA2用作COM晶體受體。COM晶體對單核細胞和巨噬細胞細胞蛋白質組的影響2010辛格托N等[42]細胞：U937細胞（全細胞）

晶體：100μg/mL COM

培養：24小時2-DE，深紫色染色，Q-TOF質譜和質譜/質譜9種上調蛋白質和13種下調蛋白質，在細胞周期，細胞結構，碳水化合物代謝，脂質代謝，mRNA加工以及蛋白質合成，穩定和降解中起作用。2013辛格托N等[43]]細胞：人巨噬細胞（全細胞）

晶體：100μg/mL COM

孵育：24小時2-DE，深紫色染色，Q-TOF質譜和質譜/質譜，吞噬作用測定，通過SIRNA敲低蛋白質7種上調和7種下調蛋白質，控制細胞結構，碳水化合物代謝，DNA/RNA加工，蛋白質代謝，分子運輸和應激反應。HSP90在巨噬細胞的吞噬體形成和吞噬活性中起著至關重要的作用。COM晶體對分泌組和外泌體蛋白質組的影響2016蔣宗華等[13]細胞：MDCK細胞（分泌組）

晶體：100μg/mL COM

培養：20小時2-DE，深紫色染色，Q-TOF MS/MS，晶體遷移測定，細胞遷移測定COM晶體誘導2個來自腎小管細胞的分泌蛋白增加和4個減少。分泌性烯醇化酶-1的增加反過來又通過ECM增強了COM晶體的侵入。2016辛提普倫格拉特K等[44]]細胞：U937細胞（分泌組）

晶體：100μg/mL COM

孵育：16小時2-DE，深紫色染色，Q-TOF質譜和質譜/質譜COM晶體誘導了14個與U937單核細胞免疫反應和細胞存活相關的分泌蛋白增加和4個減少。增加的HSP90局限于細胞表面。2018辛格托N等[45]細胞：人巨噬細胞（外泌體）

晶體：100μg/mL COM

孵育：24小時2-DE，深紫色染色，納米LC-ESI-ETD MS/MS，細胞遷移測定，吞噬作用測定，通過siRNA敲低蛋白質2種上調和4種下調外泌體蛋白。來自晶體相互作用的巨噬細胞的外泌體誘導單核細胞的遷移/活化和巨噬細胞的吞噬活性。siRNA敲低了維生素素，成功地抑制了來自COM晶體暴露巨噬細胞的外泌體的這種作用。2018辛格托N等[46]細胞：人巨噬細胞（外泌體）

晶體：100μg/mL COM

孵育：24小時納米LC-ESI-Qq-TOF，細胞遷移試驗，晶體結合試驗，晶體遷移試驗7種上調和19種下調外泌體蛋白。來自晶體相互作用巨噬細胞的外泌體誘導中性粒細胞遷移，增強腎小管細胞中促炎細胞因子IL-8的產生，與COM晶體具有更大的結合能力，并通過ECM激活晶體入侵。

2.不同劑量和類型的CaOx晶體對腎小管細胞細胞蛋白質組的影響

應用于晶體-細胞相互作用的蛋白質組學的首次研究是在2008年完成的[24]。在這項工作中，仔細建立了研究模型，表明劑量為100μg/mL（每體積培養基）的COM晶體在48小時的潛伏期不會對腎小管細胞造成嚴重的細胞毒性，并且細胞死亡百分比不會增加。因此，由COM晶體誘導的細胞蛋白質組的變化反映了細胞對COM晶體的反應，而不是它們的細胞毒性作用。此外，掃描電子顯微鏡（SEM）在與細胞孵育后顯示出COM晶體邊界的扭曲，首次表明晶體-細胞相互作用具有直接的實驗證據。使用二維凝膠電泳（2-DE）與Sypro Ruby熒光染色，然后進行四極桿飛行時間（Q-TOF）質譜（MS）和串聯MS（MS/MS），鑒定了11種上調和5種下調蛋白質，它們在轉錄/翻譯，信號轉導，細胞代謝和生長，核和細胞結構，運輸，應激反應和生物合成中起作用。其中一些蛋白質組學數據通過二維（2-D）蛋白質印跡得到證實[24]。

隨后，進行了一項亞細胞蛋白質組研究[29]，以評估100μg/mL COM晶體對線粒體蛋白質組的影響以及使用高度純化的線粒體分離方法暴露于晶體48小時的腎小管細胞的功能[47]。使用2-DE與深紫色熒光染色的比較分析，然后是Q-TOF MS和MS/MS分析，確定了12種上調和3種下調線粒體蛋白，它們調節細胞結構，代謝和能量產生。此外，Oxyblot檢測表明，COM晶體誘導線粒體功能障礙和氧化修飾蛋白在細胞中的積累[29]。

另一項使用較高劑量（200μg/mL）COM晶體的研究顯示，當腎小管細胞與COM晶體和2 mM草酸鹽一起孵育較短時間（僅12小時）時，細胞死亡不會增加[27]。使用2-DE銀染色，然后液相色譜法結合電噴霧電離MS/MS（LC-ESI MS/MS），數據顯示9種上調和3種下調細胞蛋白，其作用于能量產生，細胞增殖，凋亡，應激反應，鈣平衡和蛋白質合成。

使用高得多劑量（1000μg/mL）的COM晶體，細胞在與晶體孵育48小時后，細胞發生嚴重細胞毒性，總細胞死亡增加[25]。使用2-DE與西普羅紅寶石染色，然后進行Q-TOF MS和MS/MS分析，鑒定出25種上調和23種下調蛋白。EZRIN、烯醇化酶-1和膜聯蛋白-A1水平的降低通過2-D蛋白質印跡得到證實。有趣的是，伴侶被上調，而其他參與蛋白質合成、細胞周期調控、細胞結構和細胞信號傳導的蛋白質被下調[25]。最近使用各種測定方法進行了功能研究，以確定該表達蛋白質組學數據集的生物學相關性[31]。最初，所有顯著改變的蛋白質被提交給STRING生物信息學工具[48]以獲得蛋白質-蛋白質相互作用網絡，其揭示了細胞增殖/傷口愈合，氧化應激/線粒體功能以及細胞連接復合物/完整性是顯著改變蛋白質的主要生物學功能。驗證實驗表明，用1000μg/mL COM晶體處理的細胞毒性腎小管細胞在細胞增殖、傷口愈合能力、經上皮阻力（TER）以及閉塞-1（ZO-1）和信號蛋白RhoA的緊密連接蛋白水平方面均有所下降。相反，氧化修飾蛋白的水平升高。雖然ATP合酶α亞基前體減少，但參與能量產生和穩態的其他線粒體蛋白（例如烏頭酶、腺苷酸激酶2、泛醇-細胞色素-c還原酶）增加[25]。結果，COM處理的細胞中的細胞內ATP水平升高[31]。這些數據可能反映了COM晶體誘導的微管毒性期間發生的細胞過程[31]。

蛋白質組學還應用于研究暴露于無毒劑量（100μg/mL）的COD晶體48小時后腎小管細胞細胞蛋白質組的變化[26]。使用2-DE和Sypro Ruby染色，然后進行Q-TOF MS和MS/MS分析，數據顯示5種上調和5種下調蛋白質控制細胞代謝、結構、完整性、信號轉導和應激反應[26]。隨后，研究了100μg/mL COD晶體誘導的腎小管細胞糖蛋白組的變化[28]。使用2-DE和Pro-Q祖母綠糖蛋白染色，然后使用Sypro Ruby總蛋白染色進行歸一化，Q-TOF MS和MS/MS鑒定了16個顯著改變的糖蛋白，包括負責調節細胞-細胞解離的3個蛋白酶體亞基的糖型和在細胞完整性中起作用的肌動蛋白相關蛋白3（ARP3）。這些數據表明，COD晶體導致細胞解離并降低細胞完整性[28]。

此外，還對暴露于不同劑量和類型的CaOx晶體后腎小管細胞的功能擾動進行了比較分析[30]。表達數據的比較表明，與低劑量相比，這些晶體的高劑量引起細胞蛋白質組更明顯的變化，并且COM比COD更有效地誘導細胞蛋白質組的改變。功能分析顯示，在用高劑量COM和COD處理的細胞中，細胞內ATP，氧化修飾蛋白和細胞死亡水平較高，但泛素化蛋白水平較低。COM晶體也誘導比COD更嚴重的細胞毒性。用抗氧化劑表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對細胞進行預處理可以降低晶體誘導的氧化修飾蛋白的積累和細胞的晶體結合能力。這些數據強調了高劑量與低劑量以及COM與COD晶體在腎小管細胞中誘導功能性擾動的差異效應。研究結果還表明，氧化應激可能在用這些不同劑量/類型的晶體處理的細胞的晶體結合能力中起重要作用[30]。

然而，應該注意的是，COM/COD晶體的劑量及其暴露于所有上述體外研究中應用的細胞的時間可能并不完全代表結石成型劑中的體內狀況，這可能伴隨著腎結石發病機制的另一個模型，即Randall的斑塊模型。目前，晶體-細胞相互作用的體內研究似乎尚未用于腎結石研究，因為限制（實際上缺乏）跟蹤體內晶體-細胞相互作用的技術。當這種技術可用時，腎結石形成的致病機制將更加清晰。

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3.腎小管細胞頂端表面COM晶體受體的蛋白質組學鑒定

腎結石研究在細胞水平上取得重大飛躍的另一步是開發一種簡單但有效的剝離方法來分離和純化極化腎小管細胞的頂膜[49]。這種新方法主要依賴于所施加的表面（例如，Whatman濾紙，硝酸纖維素膜，玻璃紙或玻璃蓋玻片）的吸附能力，以利用這些表面和頂端膜之間的含水親和力和離子相互作用與頂端膜粘附。在測試的這4個表面中，濾紙是分離和純化頂端膜的最有效一種，而基底外側膜蛋白沒有任何污染，這已通過免疫印跡和免疫熒光染色證實[49]。與傳統的生化測定（主要使用基于離心的方法）相比，剝離方法在分離/純化頂端膜方面要有效得多。

該剝離方法用于分離極化腎小管細胞頂膜的高度純化部分，然后鑒定細胞表面的潛在COM晶體受體[32]。將回收的蛋白質重懸于人工尿液中，并與COM晶體一起孵育過夜。洗滌和洗脫后，凝膠增強液相色譜法，然后串聯MS（GeLC-MS/MS）共鑒定出96個潛在的COM晶體受體。其中，膜聯蛋白II作為COM晶體受體的作用通過晶體-細胞粘附試驗驗證，然后使用特異性抗膜聯蛋白II抗體進行中和[32]。此外，其他COM晶體受體也在隨后的研究中得到證實，包括α烯醇化酶[34，36]、膜聯蛋白A1[33，35]、熱休克蛋白90（HSP90）[37，40]和質膜Ca2+異肽酶2（PMCA2）[41]。

其他不作為COM晶體受體但其作用與各種COM晶體受體相關的蛋白質，包括α-微管蛋白和層粘連蛋白A/C.A-微管蛋白（一種細胞骨架蛋白）被鑒定為使用蛋白質組學方法用1000μg/mL COM晶體處理的腎小管細胞中的下調蛋白質之一[25]，并作為蛋白質-蛋白質相互作用網絡的中心節點[38]].α-微管蛋白的過表達導致3種COM晶體受體的下調，包括α烯醇化酶、熱休克蛋白70（HSP70）和HSP90，并且細胞的晶體結合能力下降[38]。相比之下，另一項蛋白質組學研究發現，層粘連蛋白A/C（一種核層蛋白）是用100μg/mL COM晶體處理的腎小管細胞中的上調蛋白質之一[24]，并作為蛋白質-蛋白質相互作用網絡的中心節點[39]。小干擾RNA（siRNA）敲低層粘連蛋白A/C導致4種COM晶體受體（包括維門汀、α烯醇化酶、S100和膜聯蛋白A2）的水平降低，并且細胞的晶體結合能力下降[39]。這些數據表明，層粘連蛋白A/C具有各種功能，包括調節其他蛋白質的表達。對上述COM晶體受體及其調節劑或相關蛋白質的表征可能導致進一步發展策略，通過阻斷COM晶體粘附在細胞上和晶體保留在腎內來防止腎結石的形成。

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4.COM晶體對單核細胞和巨噬細胞細胞蛋白質組的影響

CaOx晶體不僅與腎小管細胞相互作用，還與單核細胞和巨噬細胞相互作用，它們在進一步加重腎結石形成的炎癥過程中起重要作用。因此，蛋白質組研究已經研究了單核細胞/巨噬細胞響應COM晶體的作用。將人單核細胞U937細胞與100μg/mL COM晶體一起孵育24小時，并檢查細胞蛋白質組的變化[42]。使用2-DE進行深紫色熒光染色，然后進行Q-TOF MS和MS/MS分析，結果顯示9種蛋白質的水平升高，13種蛋白質的水平降低，這些蛋白質在細胞周期、細胞結構、碳水化合物代謝、脂質代謝、mRNA加工以及蛋白質合成、穩定和降解中的作用[42]。

后來，采用類似的方法研究人巨噬細胞與100μg/mL COM晶體相互作用24小時后細胞蛋白質組的變化[43]。比較蛋白質組分析揭示了7種上調和7種下調蛋白質，它們控制細胞結構，碳水化合物代謝，DNA/RNA加工，蛋白質代謝，分子運輸和應激反應。有趣的是，蛋白-蛋白相互作用網絡分析表明，HSP90直接與β肌動蛋白和α微管蛋白相互作用，所有這些相互作用的伙伴在COM處理的巨噬細胞中都上調。功能研究表明，只有肌動蛋白與HSP90共定位在被吞噬的COM晶體周圍，形成吞噬體結構。siRNA對HSP90的敲低抑制了吞噬體的形成以及COM晶體誘導的巨噬細胞的吞噬和遷移活性。這些數據表明，HSP90不僅作為COM晶體受體，而且在巨噬細胞的吞噬體形成和吞噬活性中也起著至關重要的作用[43]。

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5.COM晶體對分泌組和外泌體蛋白質組的影響

除了COM晶體誘導的細胞蛋白質組的改變外，還使用蛋白質組學方法研究了晶體-細胞相互作用對分泌組的影響。對于腎小管細胞，100μg/mL COM晶體導致2種分泌蛋白水平升高，4種分泌蛋白水平降低[13]。有趣的是，使用先前建立的基于纖溶酶原-纖溶酶活性的晶體遷移測定法進行了功能研究[50]。數據顯示，分泌性烯醇化酶-1的增加反過來又通過ECM促進COM晶體侵襲和單核細胞的遷移[13]。對于人單核細胞，用U937單核細胞孵育100μg/mL COM晶體16 h可誘導細胞中14個分泌蛋白增加和4個減少[44]。有趣的是，一項免疫熒光研究檢測到細胞表面的HSP90增加，這表明其增加的分泌可能來自非經典分泌途徑[44]。

為了證實COM可以通過非經典分泌途徑誘導分泌組的變化，隨后的研究調查了來自人類巨噬細胞的外泌體蛋白質組的改變。使用基于凝膠的[45]和無凝膠[46]定量蛋白質組學方法，鑒定出許多顯著改變的外泌體蛋白。有趣的是，暴露于COM晶體的巨噬細胞產生更高水平的白細胞介素-1β（IL-1β），這是炎癥小體活化標志物之一[51，52]。此外，來自這些晶體相互作用巨噬細胞的外泌體誘導單核細胞的遷移/活化，單核細胞產生更高水平的白細胞介素-8（IL-8）（一種促炎細胞因子），其作為旁分泌激活巨噬細胞的吞噬活性[45]。siRNA敲低了一種上調蛋白（維門汀），成功地抑制了來自COM晶體暴露巨噬細胞的外泌體的這種作用[45]。此外，來自這些晶體相互作用巨噬細胞的外泌體誘導中性粒細胞遷移，增強腎小管細胞中促炎細胞因子IL-8的產生，與COM晶體的結合能力更強，并通過ECM激活晶體入侵[46]。

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6.結論

在過去的12年中，蛋白質組學已成功應用于腎結石研究，旨在更好地了解腎結石形成的致病機制，特別是在晶體-細胞相互作用（表1).這些研究的第一階段主要涉及與COM晶體相互作用后腎小管細胞中改變的全細胞蛋白質組的表征。隨后，亞細胞蛋白質組學揭示了細胞與COM晶體相互作用后線粒體蛋白質組變化和線粒體功能障礙的其他信息。此外，對不同劑量和類型的CaOx晶體對腎小管細胞細胞蛋白質組的影響的功能研究，使得更好地理解受晶體-細胞相互作用影響的腎小管細胞的表達和功能擾動（見第2節）。在開發出一種簡單而高效的方法來從極化的腎小管細胞中純化頂膜之后，該領域發生了一個巨大的飛躍。特別是，蛋白質組學鑒定了大量潛在的COM晶體受體，然后在隨后的幾項研究中進行了功能驗證。這些發現對于進一步制定通過阻斷致病晶體與靶腎小管細胞之間的結合來預防腎結石形成的策略非常重要（見第3節）。除腎小管細胞外，蛋白質組學還應用于研究人單核細胞/巨噬細胞細胞蛋白質組的變化，這些變化導致更清楚地了解消除粘附和內化CaOx晶體和炎癥反應的機制（見第4節）。此外，還開發了幾種功能測定方法，以解決從蛋白質組學研究的初始階段鑒定的表達數據的功能意義。例如，鑒定由COM晶體誘導的改變的分泌蛋白，這反過來又加劇了通過ECM的晶體入侵。最后，最近關于巨噬細胞外泌體在腎結石形成炎癥級聯中的作用的知識提供了額外的新信息，以更好地了解晶體-細胞相互作用期間的炎癥級聯反應（見第5節）。綜上所述，所有這些發現都有助于更好地了解腎結石病的致病機制，特別是在晶體-細胞相互作用的步驟中。此外，這些發現還可能導致開發新的策略來預防新的和/或復發的腎結石的形成。